مسترمیکس رد (Taq DNA Polymerase همراه با 2x Master Mix RED)

محصول Taq DNA Polymerase 2x Master Mix RED تولید شرکت Ampliqon، یک محلول آماده به استفاده برای واکنش‌های PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) است. این محصول که با نام مسترمیکس رد نیز شناخته می‌شود، با ارائه ترکیبی از آنزیم Taq DNA Polymerase، بافر ⁺NH₄ مخصوص واکنش، MgCl₂ و چهار نوکلئوتید (dNTPs) در یک مخلوط واحد، فرآیند آماده‌سازی نمونه‌ها برای PCR را ساده‌تر و سریع‌تر می‌کند. علاوه بر این، حضور یک رنگ قرمز در مخلوط با نقش لودینگ، به کاربران اجازه می‌دهد تا به راحتی مراحل ران کردن ژل و ردیابی آن روی ژل آگارز را ساده‌تر کند. حجم این مسترمیکس رد امپلیکون حجم ۱۲۵۰ میکرولیتر دارد.

استفاده از مستر میکس رد در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی و بالینی برای انجام PCR استاندارد و تکثیر نواحی خاصی از DNA بسیار رایج است. مسترمیکس رد برای کاربردهای متنوعی از جمله بررسی‌های ژنتیکی، تشخیص بیماری‌ها، و تحقیقات بیولوژی مولکولی مناسب است.

مسترمیکس رد امپلیکون (Ampliqon Taq DNA Polymerase همراه با 2x Master Mix RED) – منبع تصویر

ویژگی‌های مسترمیکس رد امپلیکون

مسترمیکس رد مزایای چندگانه‌ای ارائه می‌دهد. زمان آماده‌سازی واکنش به طور قابل توجهی کاهش می‌یابد و احتمال آلودگی مواد اولیه حذف می‌شود. کاهش گام‌های آماده‌سازی مواد واکنش، به بهبود تکرارپذیری نتایج کمک می‌کند. آزمایش‌های استاندارد می‌توانند با اطمینان از اینکه نتایج هر بار یکسان خواهند بود، ستاپ شوند. نیازی به خرید و استفاده از رنگ‌های لودینگ جداگانه نیست. تنها کافی است بخشی از محصول واکنش را بر روی ژل آگارز برای الکتروفورز و مشاهده ران کنید.

• ترکیب اصلی 2X
• صرفه جویی در زمان آماده سازی واکنش
• بارگذاری و ران کردن محصول بصورت مستقیم روی آگارز
• مشاهده آسان هنگام پیپتینگ
• رنگ ردیاب قرمز
• افزایش تکرارپذیری واکنش
• بازده بالای واکنش
• پردازش تا ۵ کیلو باز

برای استفاده، کافی است نمونه DNA و پرایمرهای مورد نیاز را به مخلوط اضافه کرد و سپس واکنش PCR را اجرا کرد. این محصول باید در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شود تا استحکام و کارایی آن حفظ شود. همچنین، برای جلوگیری از آلودگی و حصول نتایج دقیق، توصیه می‌شود که هنگام کار با این محصول، از تجهیزات حفاظتی مناسب استفاده شود و دستورالعمل‌های ایمنی رعایت گردد.

رنگ قرمز ردیاب و ماده استابیلایزر موجود در محصول، هیچ تداخلی با فرآیند PCR ایجاد نمی‌کنند. در صورت نیاز، می‌توان رنگ قرمز را از محصول PCR با استفاده از روش‌هایی مانند تصفیه با ستون چرخشی یا روش‌های دیگر حذف کرد. علاوه بر این، محصولات PCR که با استفاده از Taq DNA Polymerase Master Mix RED DNA تولید شده‌اند، را می‌توان با کیت بازیابی اسید نوکلئیک از واکنش های آنزیمی (PCR) دنازیست بازیابی کرد.

رنگ قرمز ردیاب و ماده استابیلایزر موجود در محصول، نقش رنگ لودینگ حین ران کردن ژل الکتروفورز را ایفا میکند – منبع تصویر

رنگ قرمز با عملکرد PCR تداخلی ایجاد نمی‌کند. دو هدف DNA متفاوت؛ PAH (203 جفت‌باز) و BAIP (788 جفت‌باز) با استفاده از مسترمیکس رد امپلیکون تکثیر شدند و روی ژل آگارز دیده شدند – منبع تصویر

پس از پایان انجام PCR و تکثیر DNA مورد نظر، محصولات PCR را می‌توان مستقیماً روی ژل آگارز و ژل‌های DNA SDS ران کرد. رنگ قرمز مشاهده، پیپتینگ و ران کردن محصول نهایی روی ژل را ساده و فراهم می‌کند. این رنگ قرمز با عملکرد PCR تداخلی ندارد.

ترکیبات محلول مسترمیکس رد

ترکیبات مسترمیکس Taq DNA Polymerase 2x RED (با غلظت نهایی ۱٫۵ میلی‌مول MgCl₂) شامل موارد زیر است:

• Tris-HCl با pH 8.5 به همراه بافر آمونیوم سولفات و MgCl₂ با غلظت ۳ میلی‌مولار، غلظت ۰٫۲٪ محلول Tween^Ⓡ 20
• ۰٫۴ میلی‌مول از هر یک از dNTPها
• آنزیم Taq DNA Polymerase تولیدی Ampliqon
• رنگدانه قرمز بی‌اثر و استابیلایزر

توصیه‌های مربوط به نگهداری ‎و پایداری

نگهداری طولانی‌مدت محصول در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد توصیه می‌شود. تاریخ انقضای محصول در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد بر روی برچسب آن ذکر شده است.

گزینه دیگر: نگهداری در دمای ۴+ درجه سانتی‌گراد تا مدت ۶ ماه امکان‌پذیر است.

کنترل کیفیت مستر میکس رد

آنزیم Taq DNA Polymerase برای فعالیت‌های آلودگی‌زا تست شده و هیچ‌گونه ردی از فعالیت اندونوکلئاز، فعالیت نیکینگ یا فعالیت اگزونوکلئاز در آن یافت نشده است.

مقایسه عملکرد مسترمیکس رد با سه رقیب آن

مسترمیکس رد Taq DNA Polymerase RED امپلیکون با مسترمیکس‌های مشابه Taq DNA Polymerase با رنگ سبز از سه رقیب پیشرو در بازار؛ با نام‌های مستعار T، K، و P مقایسه شده‌اند. شش DNA هدف مختلف با طول‌های متفاوت شامل BAIP (۷۸۸ جفت‌باز)، Q8 (۷۲۷ جفت‌باز)، CFTR (۶۱۳ جفت‌باز)، ENG5 (۲۹۳ جفت‌باز)، ENG9 (۲۹۳ جفت‌باز) و PAH (۲۰۳ جفت‌باز) ارزیابی شدند. مسترمیکس رد Taq DNA Polymerase RED شرکت Ampliqon به اندازه یا بهتر از سه مسترمیکس مشابه Taq DNA Polymerase با رنگ سبز در شش هدف پرایمری آزمایش‌شده در این ستاپ عمل کرد. علاوه بر این، مسترمیکس Taq RED از تکثیر با بازده بالا در هدف غنی از GC مانند ENG5 پشتیبانی می‌کند، در حالی که مسترمیکس‌های رنگ سبز از رقبای T و P اصلاً هدف DNA ENG5 را تکثیر نمی‌کنند. هر تکثیر بر اساس دستورالعمل‌های ارائه‌شده توسط تولیدکنندگان انجام شده است – منبع تصویر

برای ست آپ یک واکنش PCR با حجم ۲۵ میکرولیتر اجزای زیر را به تیوب روی یخ اضافه کنید: 

۱- مسترمیکس: ۱۲٫۵ میکرولیتر؛
۲- پرایمر رفت: ۱۰ میکرومولار: ۰٫۵ میکرولیتر؛
۳- پرایمر برگشت: ۱۰ میکرومولار: ۰٫۵ میکرولیتر؛
۴- نمونه DNA: حجم متغیر بسته به نوع و کاربرد (DNA ژنومیک ۲۰ نانوگرم، DNA پلاسمیدی ۰٫۵ نانوگرم، DNA باکتری ۵ نانوگرم)؛
۵- آب فاقد نوکلئاز: باقیمانده حجم تا ۲۵ میکرولیتر.

روش استفاده از مسترمیکس رد امپلیکون

پروتکل مسترمیکس رد که در تب «بروشور» این صفحه قابل مشاهده و دانلود است، به عنوان راهنما برای اطمینان از نتایج بهینه PCR هنگام استفاده از مسترمیکس Taq DNA Polymerase 2x RED عمل می‌کند. شرایط واکنش بهینه مانند زمان‌های انکوباسیون، دماها، و مقدار DNA تمپلیت، ممکن است با توجه به واکنش مورد نظر شما متغیر باشد و باید به صورت جداگانه تعیین شوند.

مخلوط واکنش را آماده کنید. جدول ۱ در فایل pdf پروتکل، نحوه ستاپ واکنش برای حجم نهایی ۵۰ میکرولیتر را نشان می‌دهد. در صورت تمایل، می‌توان اندازه واکنش را کاهش داد. از ۱۰ میکرولیتر مسترمیکس رد برای بدست آوردن حجم نهایی ۲۰ میکرولیتری استفاده کنید.

مخلوط واکنش را به خوبی مخلوط کرده و حجم‌های مناسب را در تیوب‌های واکنش بریزید. به آرامی مخلوط کنید، مثلاً با چند بار بالا و پایین کردن محلول واکنش با پیپت.

تمپلیت DNA را به تیوب‌هایی که حاوی مخلوط واکنش هستند اضافه کنید.

دستگاه ترموسایکلر را بر اساس دستورالعمل‌های تولیدکننده ستاپ کنید. برای مثال به جدول ۲ فایل پروتکل مراجعه کنید.

تیوب‌ها را در ترموسایکلر (دستگاه PCR) قرار دهید و واکنش را شروع کنید.

در پایان اجرا، تنها کافی است بخشی از محصول واکنش (مثلاً ۱۰ میکرولیتر) را برای تحلیل روی ژل آگارز ران کنید.

نکات قابل توجه در رابطه با غلظت منیزم کلراید

غلظت نهایی MgCl₂ در این مسترمیکس ۱٫۵ میلی‌مول است. در برخی کاربردها، برای رسیدن به بهترین نتایج، نیاز به بیش از غلظت ۱٫۵ میلی‌مول MgCl₂ است. از محلول منیزیم کلرید با غلظت میلی‌مول برای تنظیم غلظت ⁺Mg₂ طبق جدول ۳ در پروتکل استفاده کنید.

تست پایداری مسترمیکس‌ها

تست پایداری (Stability Test) مسترمیکس‌ها

آنزیم Taq DNA Polymerase شرکت Ampliqon، یک آنزیم بسیار پایدار با نیمه‌عمر ۴۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتی‌گراد است. نیمه‌عمر این آنزیم با کاهش چند درجه‌ای دما به سرعت افزایش می‌یابد. برای ارزیابی پایداری حرارتی، دنازیست فعالیت آنزیم Taq را در سه دمای مختلف را آزمایش کرده است.

نتایج دنازیست نشان می‌دهد که این آنزیم در برابر انکوباسیون در دماهای بالا برای مدت‌های طولانی بدون از دست دادن فعالیت مقاوم است:

• در ۴۰ درجه سانتی‌گراد برای ۲ هفته؛
• در ۲۵ درجه سانتی‌گراد (دمای اتاق) برای ۲ ماه
• و در ۵ درجه سانتی‌گراد برای ۱۸ ماه.

آنزیم Taq DNA Ampliqon می‌تواند تعداد زیادی (۴۰) چرخه یخ‌زدایی-انجماد را با کاهش جزئی در فعالیت تحمل کند. در دماهای پایین‌تر، آنزیم Taq برای مدت زمانی حتی طولانی‌تر پایدار است. بنابراین نگهداری در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد توصیه می‌شود تا عمر مفید ماکزیمم تضمین شود. با این حال، اگر آنزیم خود را برای چند روز روی میز آزمایشگاه فراموش کنید، به دلیل پایداری بالای آنزیم Taq در دمای اتاق، آسیبی به آن وارد نمی‌شود (البته بهتر است از این کار خودداری کنید).

دانلود فایل pdf تست پایداری مسترمیکس‌ها

Taq DNA Polymerase Master Mix RED is a ready to use 1.1x or 2x master mix. Taq DNA Polymerase Master Mix RED is available in two final MgCl₂ concentrations: 1.5 mM and 2.0 mM. Taq DNA Polymerase Master Mix RED is composed of Ampliqon Taq DNA Polymerase, the NH₄⁺ buffer system, dNTPs and magnesium chloride.