کلونینگ مولکولی

کلونینگ مولکولی (Molecular Cloning)

کلونینگ مولکولی به فرآیندی اطلاق می‌شود که توسط آن مولکول‌های نوترکیب DNA تولید، به یک ارگانیسم میزبان انتقال داده شده، و در آنجا تکثیر می‌یابند. یک واکنش کلونینگ مولکولی معمولاً شامل بر دو جزء اصلی زیر می‌باشد:

۱- قطعه DNA مورد نظر یا اینسرت ( Insertیا DNA fragment of interest)؛
۲- وکتور/ پلاسمید که شامل تمام اجزاء لازم برای تکثیر در ارگانیسم میزبان است.

DNA مورد نظر یا ژن هدف

 DNA مورد نظر (یا ژن هدف؛ Gene of interest) می‌تواند یک ژن، عناصر تنظیم‌کننده یا اپرون، یک پروموتر یا هر قطعه دیگری باشد. آن را می‌توان با روش‌های مختلفی برای کلون کردن آماده کرد:

• DNA مورد نظر را می‌توان با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده از یک منبعِ DNAی دیگر مانند وکتور/ پلاسمید یا DNA ژنومی برش زد.
• با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، قطعه DNAی مورد نظر را می‌توان تکثیر کرد.
• قطعه DNAی مورد نظر را می‌توان با به هم چسباندن (Annealing) اولیگونوکلئوتیدهای تک رشته‌ای مونتاژ کرد.

وکتور/ پلاسمید

پلاسمید (پلازمید) یک قطعه کوچک و حلقوی از DNA است که در داخل سلول میزبان (مجزا از DNA کروموزومی یا ژنومی) تکثیر می‌یابد. اغلب پلاسمیدهای رایج مورد استفاده در تکنولوژیِ DNA نوترکیب، به منظور مطالعه و دستکاری ژن‌ها بهینه شده‌اند. به عنوان مثال بیشتر پلاسمیدها در باکتری E. coli تکثیر می‌شوند و دارای اندازه‌ی نسبتاً کوچک (∼ 3000 تا 6000 جفت باز) برای دستکاری آسان می‌باشند. با اتصال فیزیکیِ DNA مورد نظر به وکتور/ پلاسمید، از طریق پیوندهای فسفودی استر، DNA مورد نظر بخشی از پلاسمیدِ نوترکیب جدید می‌شود.

وکتور/ پلاسمیدها این امکان را فراهم می‌کنند تا DNA مورد نظر در مقادیر زیادی (در سلول میزبان) کپی شوند، و اغلب عناصر کنترلی لازم برای هدایت رونویسی و ترجمه DNA کلون شده را فراهم می‌کنند. به این ترتیب وکتورها برای بسیاری از روش‌های مولکولی مانند بیان پروتئین، بررسی بیان ژن و آنالیز عملکردی مولکول‌های زیستی، ابزارهای مناسب و کاربردی هستند. به طور معمول پلاسمیدها حاوی حداقل توالی DNA لازم برای این منظور هستند؛ شامل منشاء همانندسازی DNA (DNA replication origin)، ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک (Antibiotic-resistance gene) و ناحیه‌ای که در آن، قطعات DNA خارجی را می‌توان وارد کرد.

هنگامی که یک پلاسمید در E. coli بصورت خارج کروموزومی (Extrachromosomal) وجود دارد، به طور مستقل تکثیر می‌شود و به سلول‌های دختر حاصل از تقسیم، به ارث می‌رسد. این سلول‌های دختری، حاوی اطلاعات ژنتیکی مشابه با سلول مادری خود هستند و بنابراین به آنها کلون سلول اصلی (Clones of the original cell) گفته می‌شود. DNA پلاسمیدی به طور مشابه، DNA کلون شده (Cloned DNA) نامیده می‌شود. فرایندِ تولید چندین نسخه یکسان از یک مولکول DNAی نوترکیب نیز، به عنوان کلونینگ (کلون‌سازی)DNA یا کلونینگ مولکولی (DNA or molecular cloning) شناخته شده است.

فرآیند کلونینگ مولکولی به دانشمندان این امکان را می‌دهد تا کروموزوم‌ها و ژن‌ها را مورد مطالعه قرار دهند. امروزه دانشمندان می‌توانند ژن‌ها و سایر عناصر ژنتیکی را به راحتی با استفاده از پلاسمیدهایی که بطور خاص مهندسی شده‌اند، مورد مطالعه و دستکاری قرار دهند و به این ترتیب پلاسمیدها تبدیل به ابزارهای قدرتمندی در ژنتیک مولکولی شده‌اند.

در جدول زیر تعدادی از عناصر اصلی به کار رفته در پلاسمیدها توضیح داده شده‌اند:

برای خطی کردن وکتور/ پلاسمید مورد نظر بمنظور آماده‌سازی برای کلون کردن اینسرت، از آنزیم‌های محدودکننده یا PCR استفاده می‌شود.

در طی فرآیند کلونینگ، انتهای DNA مورد نظر و وکتور/ پلاسمید باید اصلاح گردد تا برای اتصال توسط DNA لیگاز (DNA ligase)، ریکامبیناز (Recombinase)، توپوایزومراز (Topoisomerase) یا مکانیسم‌های داخل سلولیِ ترمیم DNA، هر دو انتهای آن‌ها باهم سازگار شوند. برای این منظور معمولا از آنزیم‌هایی مانند نوکلئازها، فسفاتازها، کینازها و یا لیگازها استفاده می‌کنند.

امروزه روش‌های زیادی برای ساده‌تر کردن و استانداردسازی انجام کلونینگ مولکولی معرفی شده‌اند و همچنین کیت‌های جدیدی نیز برای این منظور توسط شرکت‌های مختلف ساخته شده‌اند. این موضوع در یادداشت‌های بعدی توضیح داده خواهد شد. در این یادداشت تنها روش مرسوم و کلاسیک کلونینگ مولکولی توضیح داده می‌شود.  

کلونینگ مرسوم یا کلاسیک (Traditional Cloning)

اگرچه امروزه نسل‌های جدیدی از مونتاژ DNA (DNA assembly) و کلونینگ مولکولی معرفی شده‌اند، با این حال استفاده از روش‌های کلاسیک کلونینگ (Traditional Cloning) هنوز در بسیاری آزمایشگاه‌ها متداول است.

در کلونینگ کلاسیک از آنزیم‌های محدودکننده برای خطی (Linearize) کردن وکتور/ پلاسمید و خارج کردن قطعه DNA مورد نظر از یک منبع DNA استفاده می‌شود، بطوری که ضمن برش با این آنزیم‌ها، انتهاهای سازگار ایجاد می‌گردد. پس از تخلیص وکتور خطی و DNA مورد نظر (Insert)، با فعالیت آنزیمی DNA-لیگاز (DNA ligase)، این دو بهم متصل شده و وکتور نوترکیبِ جدید بمنظور تکثیر مولکول نوترکیب، به یک میزبان E. coli وارد (Transform) می‌شود.

صرف نظر از این که کدام روش کلونینگ انتخاب شده باشد، با پیروی از پروتکل‌های خوب و مناسب در آزمایشگاه می‌توان این فرایند را مؤثرتر و موفق‌تر انجام داد. در ادامه به معرفی نکات مهم در یک پروژه کلونینگ و همچنین مراحل انجام کلونینگ کلاسیک می‌پردازیم.

۸ نکته مهم برای داشتن یک کلونینگ مولکولی موفق

۱- زمان کافی برای طراحی آزمایش‌های خود اختصاص دهید

توجه به جزئیات هنگام طراحی و برنامه‌ریزی برای یک پروژه کلونینگ ضروری است. با درک کاملی از روش‌های مورد استفاده و توالی‌‌های تولید شده، اطمینان حاصل کنید که طراحی شما صحیح و دقیق است. به اتصال توالی‌ها و اثر آن بر روی چارچوب خوانش (Open reading frame; ORF) هر توالیِ کدکننده توجه کنید. به جایگاه‌های شناسایی آنزیم‌های محدودکننده (Restriction site of restriction enzyme)، هم در وکتور و هم در DNA مورد نظر (Insert)، قبل از طراحی پرایمرهای PCR (که حاوی سایت‌های شناسایی مشابه با آنچه در کلونینگ استفاده می‌شوند، هستند) دقت کنید. مطمئن شوید که نشانگر انتخابی آنتی‌بیوتیکی (Antibiotic selective marker ) در وکتور، با نژاد میزبان انتخابی سازگار باشد. پیشنهاد می‌شود قبل از شروع کار در آزمایشگاه، مراحل انجام پروژه کلونینگ خود را در نرم افزار‌های آنلاین و یا آفلاین مخصوص این کار، شبیه‌سازی کنید.

۲- با یک DNA تمیز و در غلظت مناسب شروع کنید

اطمینان از اینکه منبع DNA شما عاری از آلاینده‌ها، از جمله نوکلئازها و فعالیت‌های آنزیمی ناخواسته است، مهم می‌باشد. استفاده از کیت‌های مبتنی بر ستون مانند کیت‌های استخراج از محصول PCR، و استخراج از ژل ستونی برای خالص‌سازی DNA، روش خوب و مناسبی است. قبل از دستکاری DNA، تمام حلال‌ها از جمله فنل، کلروفرم و اتانول را کاملاً حذف کنید. اطمینان حاصل کنید که شستشوی نهایی و خروج DNA از ستون‌ها، با بافر عاری از نمک انجام شده باشد. به این ترتیب مانع از مهار مراحل پایین دست مانند برش با آنزیم‌های محدودکننده و یا تکثیر با PCR می‌شوید. برای تکنیک مورد استفاده در پروژه کلونینگ خود مقدار کافی از DNA وارد واکنش کنید. بمنظور برش با آنزیم‌های محدودکننده، اغلب بین 2/0 تا 2 مایکروگرم نیاز است، در حالی‌که تنها مقادیر بسیار کمی (در حد نانوگرم) از DNAی الگو برای انجام PCR کافی است.

۳-  برش با آنزیم‌های محدودکننده را با دقت انجام دهید

مهم است که هنگام برش DNA، واکنش هضم با آنزیم را به درستی تنظیم کنید. حجم واکنش باید با مرحله پایین دست، سازگار باشد به عنوان مثال باید کمتر از حجم چاهک ژل آگارز ِمورد استفاده برای جدا کردن قطعات DNA باشد. اغلب حجم یک واکنش کلونینگ کلاسیک، بین 20 تا 50 مایکرولیتر است. حجم آنزیم (های) محدودکننده اضافه شده نباید بیش از 10٪ از حجم کل واکنش باشد، تا اطمینان حاصل شود که غلظت گلیسرول زیر 5٪ در واکنش باقی می‌ماند. این نکته برای به حداقل رساندن فعالیت ناخواسته و غیر اختصاصی آنزیم‌های محدود کننده (Star activity) مهم و ضروری است.

۴- به انتهاهای ایجاد شده توجه کنید

با فرض اینکه انتهاهای ایجاد شده برای اتصال سازگار باشند، یعنی دارای انتهای چسبنده‌ی (Overhang یا Sticky end) مکمل یا انتهای صاف (Blunt end) باشند، DNAی مورد نظر و وکتور بدون اصلاحِ بیشتر برای کلونینگ آماده هستند. اما اگر انتهاهای آن‌ها سازگار نباشند، باید با استفاده از روش‌های مناسب اصلاح شوند (به عنوان مثال از blunting reagents، فسفاتازها و غیره استفاده شود).

اگر برای آماده‌سازی انتهاهای DNA، از PCR و DNAپلیمرازِ Taq (Taq DNA Polymerase) استفاده می‌شود، یک نوکلئوتید آدنین (A) اضافی در انتهای 3 پرایم آن باقی می‌ماند. استفاده از DNAپلیمرازهای High-fidelity (High-fidelity DNA polymerases)، انتهای صاف ایجاد می‌کند. انجام PCR، با استفاده از پرایمرهای تجاری استاندارد، قطعات غیرفسفریله تولید می‌کند، مگر اینکه پرایمرها در انتهای 5 پرایم خود فسفریله باشند. محصول PCR ممکن است قبل از اتصال به یک وکتور دفسفریله، نیاز داشته باشد تا با یک آنزیم کیناز (مانند T4 Polynucleotide Kinase; T4 PNK) تیمار شود تا یک گروه فسفات در انتهای 5 پرایم آن اضافه گردد.

۵- قبل از اتصال وکتور به DNA مورد نظر، هر دو جزء را تمیز کنید

 استفاده از کیت‌های استخراج محصول PCR (یا PCR & DNA Cleanup Kit)، در مواردی که قطعه DNA مورد نظر توسط PCR تکثیر می‌یابد، می‌تواند نتایج کلونینگ شما را به طرز چشمگیری بهبود بخشد. همچنین استفاده از الکتروفورز ژل آگارز برای جداسازیِ قطعه DNA مورد نظر از سایر قطعات ناخواسته (پس از هضم با آنزیم) متداول است. در این روش قطعه DNA مورد نظر در زیر نور UV از روی ژل برش زده می‌شود و در نهایت با استفاده از کیت استخراج ژل قابل بازیابی است. استفاده از طول موج بلند (365 نانومتر) برای به حداقل رساندن هرگونه آسیب DNA ناشی از اشعه ماوراء بنفش پیشنهاد می‌گردد.

۶- مقادیر قطعات (DNA) خود را اندازه گیری کنید

با روش‌های ساده سنجش کمی مانند الکتروفورز ژل با استانداردهای مشخص (Gel electrophoresis with mass standards) یا طیف سنجی با استفاده از اسپکتروفتومترهای با ورودی کم (مانند نانودراپ)، از مناسب بودن مقادیر مواد برای انجام واکنش اتصال (Ligation reaction) اطمینان حاصل کنید.

۷- دستورالعمل‌های شرکت‌های سازنده را برای واکنش اتصال (joining/ligation) دنبال کنید

برای کلونینگ معمولی دستورالعمل‌های تعیین‌شده توسط شرکت تهیه‌کننده لیگاز را دنبال کنید. اگر نسبت مولی 1 به 3 قطعه مورد نظر (Insert) به وکتور توصیه می‌شود، در ابتدا برای رسیدن به بهترین نتیجه این نسبت را امتحان کنید. استفاده از این نسبت 1 به 3 ثابت نیست و بسته به پیچیدگی پروژه کلونینگ شما می‌تواند تغییر کند.

سایت‌های مختلفی برای محاسبه‌ی نسبت مولیِ قطعه مورد نظر (Insert) به وکتور وجود دارد، که برای نمونه لینک تعدادی از آن‌ها در زیر آورده شده است.

https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation

http://www.insilico.uni-duesseldorf.de/Lig_Input.html

https://worldwide.promega.com/resources/tools/biomath

۸- از سلول‌های مستعد (Competent cell) متناسب با نیازهای خود استفاده کنید

اگرچه پروتکل‌های زیادی برای مستعدسازی سلول میزبان وجود دارد، ولی استفاده از سلول‌های مستعد تجاری می‌تواند باعث صرفه‌جویی در وقت و منابع شما شود و کلونینگ شما قابل تکرار خواهد بود.

مراحل کار کلونینگ مولکولی کلاسیک

۱- برش DNA

بمنظور برش پلاسمید پذیرنده (Recipient plasmid) و پلاسمید دهنده (Donor plasmid)، آنزیم‌های محدودکننده‌ی مناسبی را انتخاب کنید. از آنجا که مقداری DNA در مرحله‌ی استخراج ژل از دست می‌رود، بنابراین هضم آنزیمی مقادیر کافی از DNA اهیمت زیادی دارد. 5/1 تا 2 مایکروگرم از پلاسمید دهنده و 1 مایکروگرم از پلاسمید گیرنده توصیه می‌شود. همچنین برش کامل پلاسمید گیرنده مهم است. بنابراین مدت زمان هضم آنزیمی بایستی حداقل 4 ساعت و حتی تا یک شب کامل (overnight) باشد.

اگر قصد دارید فقط از یک آنزیم محدودکننده یا آنزیم‌هایی استفاده کنید که انتهاهای صاف و یا چسبنده‌ی مکمل پس از هضم ایجاد می‌کنند، برای جلوگیری از حلقوی شدن مجدد (یا Self-ligation) پلاسمید گیرنده، باید از فسفاتاز استفاده کنید. برای این منظور پلاسمید گیرنده برش خورده قبل از مرحله‌ی اتصال (Ligation) و یا قبل از استخراج ژل (بسته به نوع فسفاتاز)، معمولا با CIP (Calf alkaline phosphatase) و یا SAP (Shrimp alkaline phosphatase) تیمار می‌شود.

۲- استخراج از ژل قطعات برش خورده وکتور و قطعه مورد نظر (Insert)

قطعات ایجاد شده‌ی حاصل از هضم آنزیمی DNA را با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز از یکدیگر جدا کنید. سپس قطعه‌ی مورد نظر خود را بمنظور بازیابی آن از ژل، برش بزنید. داشتن باندهای خوب و واضح و همچنین فضای کافی برای برش زدن باندها در این مرحله مهم است. بنابراین توصیه می‌شود از یک شانه ژل دارای دانه های بزرگ (که چاهک‌های بزرگ در ژل ایجاد می‌کند) استفاده کنید، بین نمونه‌ها یک چاهک فاصله بگذارید و اجازه دهید تا ژل آهسته ران شود. علاوه بر استفاده از DNAسایز مارکرهای استاندارد، پیشنهاد می‌شود نمونه‌ی برش نخورده (Uncut) از هر پلاسمید را در کنار نمونه‌ی برش خورده‌ی آن، روی ژل ران کنید تا در صورتی‌که هضم شما مطابق انتظار نباشد، در رفع عیب‌یابی کمک کند. پس از خالص‌سازی و استخراج از ژلِ پلاسمید پذیرنده و قطعه مورد نظر (Insert)، غلظت DNA بازیابی شده را تعیین کنید.

۳- اتصال قطعه مورد نظر (Insert) به وکتور

برای اتصال Insert به پلاسمید گیرنده خود از یک لیگاز (DNA ligase) استفاده کنید. در یک واکنش اتصال (Ligation reaction) حدود 100 نانوگرم DNA کل پیشنهاد می‌شود. ایده آل‌ترین نسبت مولی پلاسمید به Insert، نسبت 1 به 3 است. از آنجایی که تعداد جفت بازهای هر کدام متغیر است، محاسبه این نسبت بر اساس غلظت DNA به تنهایی، دشوار است. بنابراین انجام دو واکنش اتصال برای ساخت هر پلاسمید نوترکیب، با نسبت‌های مختلف پلاسمید به Insert توصیه می‌شود.

همچنین داشتن نمونه‌های کنترل منفی بطور موازی با واکنش اتصال اصلی (نمونه تست) بسیار مهم است. به عنوان مثال واکنش اتصال DNAی پلاسمیدی بدون حضور Insert، نشان می‌دهد چه میزان پلاسمید پذیرنده برش نخورده به دلیل حلقوی شدن مجدد آن (Self-ligation) در واکنش وجود داشته است.

۴- ترانسفرم کردن (Transformation)

محصول واکنش اتصال را به باکتری مورد نظر خود ترانسفرم (Transform) یا وارد کنید. دستورالعمل‌های شرکت سازنده سلول‌های مستعد (competent cells) را دنبال کنید. برای اکثر کلونینگ‌های استاندارد، حدود 1 تا 2 مایکرولیتر از محصول واکنش اتصال را به سلول‌های میزبان مستعد مانند DH5alpha یا TOP10 ترانسفرم می‌کنند. تعداد کلونی‌های باکتریایی حاصل از ترانسفرماسیون شما نشانه‌ی خوبی است برای ارزیابی اینکه آیا ترانسفرماسیون شما کار کرده است یا خیر. پلیت حاوی پلاسمید گیرنده و Insert (نمونه تست) باید بطور قابل توجهی دارای کلنی‌های بیشتری نسبت به پلیت حاوی پلاسمید گیرنده به تنهایی (نمونه کنترل منفی) باشد.

۵- استخراج پلاسمید نوترکیب

در نهایت باید کلنی‌های باکتریایی را بطور جداگانه انتخاب و برداشت کرده و بمنظور استخراج پلاسمید و ارزیابی موفقیتِ واکنش اتصال، در محیط کشت مایع مناسب کشت دهید.

۶- آنالیز پلاسمید نوترکیب

پس از خالص‌سازی DNA (استخراج پلاسمید)، باید از صحت پلاسمید نوترکیب مطمئن شوید. یکی از روش‌های تایید اولیه‌ی وارد شدن Insert در پلاسمید پذیرنده، انجام کلنی PCR با استفاده از پرایمرهای مناسب است. پیشنهاد می‌شود یک پرایمر روی Insert و پرایمر دیگر روی پلاسمید انتخاب شود. به این تربیب فقط در صورتی‌که Insert در جایگاه مورد نظر قرار گرفته باشد، باند مورد نظر مشاهده خواهد شد. همچنین می‌توان از آنزیم‌های محدود کننده مناسب برای تایید اولیه استفاده کرد. پس از برش با آنزیم‌های مناسب، سایز قطعات ایجاد شده در پلاسمید حاوی Insert باید متفاوت از سایز قطعات ایجاد شده در پلاسمید بدون اینسرت (Self-ligated) باشد، و یا از آنزیمی استفاده شود که فقط دارای یک جایگاه برش روی Insert است. در این صورت فقط زمانی پلاسمید خطی می‌شود که حتما قطعه‌ی مورد نظر در پلاسمید پذیرنده وجود داشته باشد. پس از تایید ابتداییِ ورود Insert در پلاسمید پذیرنده، بمنظور اطمینان قطعی از صحت کار، پلاسمید مورد نظر را تعیین توالی (Sequencing) کنید.

منابع

Traditional Cloning Guide | NEB
Image Sources: Main Pic | Plasmid Map | Traditional Cloning Steps | Traditional Cloning Process

تهیه شده توسط دپارتمان بیولوژی مولکولی شرکت دنازیست آسیا