راهنمای طراحی پرایمرهای PCR

مقدمه

واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR; polymerase chain reaction) یکی از مهمترین تکنیک‌های بیولوژی مولکولی است که برای تکثیر مولکول‌های DNA الگو به کار برده می‌شود. کاربرد واژه الگو برای یک مولکول DNA به این معنی است که تمام یا بخشی از توالی این مولکول شناخته شده است و لذا برای تمام یا بخشی از آن امکان طراحی پرایمر یا الیگونوکلئوتید (راه انداز یا Primer) وجود دارد. اتصال پرایمر به بخشی از توالی الگو، نواحی کوتاه دو رشته ای را به وجود می‌آورد که محل اتصال آنزیم DNA polymerase می‌شوند. پرایمرها با فعالیت این آنزیم به تدریج بلندتر شده و از توالی مکمل رشته بلند (الگو) برخوردار می‌شوند. پرایمرها نقش اساسی در تعیین محل تکثیر دارند. در این یادداشت، نکات مهم در طراحی پرایمرهای PCR مرور می‌شوند.

نکات مهم در طراحی پرایمرهای PCR

طول پرایمر

طول مناسب پرایمر ۱۸ تا ۲۲ باز می‌باشد.

دمای ذوب پرایمر

دمای ذوب پرایمر (Primer melting temperature – Tm) موید ثبات ساختار دو رشته ای DNA است. در اینجا منظور از ساختار DNA دو رشته ای، باند شدن و اتصال پرایمر به مولکول الگو می‌باشد. دمای ذوب پرایمر، دمایی است که در آن نیمی از مولکول‌های پرایمر، تک رشته‌ای هستند و نیمی دیگر به مولکول DNA متصل شده و دو رشته‌ای شده‌اند. لذا این دما به یک شرایط تعادل اشاره می‌کند که در این تعادل مولکولهای پرایمر تک رشته‌ای، مولکول‌های تارگت تک رشته‌ای، مولکول‌های تارگت دارای پرایمر متصل شده، و مولکول‌های تارگت دارای پرایمرهای در حال جدا شدن همگی در حال تعادل می‌باشند.

دمای اتصال پرایمر

در دمای اتصال پرایمر (Primer annealing temperature – Ta)، پرایمر به طور خیلی اختصاصی به تارگت اصلی خود می‌چسبد. هر چقدر دمای Ta بیشتر باشد، اتصال ویژه و اختصاصی از احتمال بیشتری برخوردار است. این در حالی است که امکان باقی ماندن این اتصال از لحاظ زمانی کوتاهتر است. هر چقدر این اتصال از ثبات کمتری برخوردار باشد، آنزیم فرصت کمتری برای ساخت محصول پیدا می‌کند و لذا کل تکثیر در واکنش PCR کم می‌شود. لذا دمای Ta بسیار بالا منجر به هیبریدیزاسیون ناکافی پرایمر با الگو شده و در نتیجه محصول PCR کاهش می‌یابد. در مقابل، Ta بسیار پائین ممکن است منجر به ایجاد محصولات غیراختصاصی شود.

محتوای GC پرایمر

در Primer GC content این که چه مقدار از طول پرایمر را چه بازهایی تشکیل می‌دهند مهم است. محتوای GC بهتر است بین ۴۰ تا ۶۰ درصد باشد. این بدان معنی است که محتوای AT می‌بایست بین ۶۰ تا ۴۰ درصد می‌باشد.

گیره GC در انتهای پرایمر

توصیه می‌شود دو باز انتهای ‘3 پرایمر، بازهای G و C باشند که به آن گیره GC در انتهای پرایمر یا GC Clamp گفته می‌شود.

تکرارهای ۲ بازی در پرایمر

به لحاظ تعریف، تکرار بازها (Repeats) به معنای وجود دو باز تکرار شونده (مثلا ATATAT) در توالی پرایمر است.

تکرارهای پشت سرهم یک باز در پرایمر

به لحاظ تعریف، تکرار زیاد یک باز به طور پشت سر هم ران (Runs) نامیده می‌شود. برای مثال در پرایمر AACCCCCTTAAGGCC برای باز C ران ۵ عددی وجود دارد.

ساختارهای ثانویه پرایمر

قابلیت اتصال بازها درون یک پرایمر (primer self-complementarity) موجب تولید ساختارهای ثانویه (Secondary structures) نامناسبی می‌شود که روی موفقیت واکنش PCR اثر سوء دارند. از انجا که اتصال بازها با یکدیگر باعث تا شدن پرایمر می‌شود، به اصطلاح ساختارهای سنجاق سری (hairpin structures) تولید می‌شوند.

پرایمر دایمر

اتصال پرایمرها به یکدیگر (Primer dimer) می‌تواند به یکی از حالت‌های زیر باشد:

پرایمرهای forward به یکدیگر و پرایمرهای reverse به یکدیگر. این نوع اتصالات را self-dimer می‌نامند.

امکان دارد پرایمرهای forward و reverse به یکدیگر به صورت heterodimer وصل شوند. در این صورت هر پرایمر برای دیگری الگو شده و با فعالیت پلی مراز ادامه هر کدام ساخته می‌شود.

نتیجه گیری

در این پست از بلاگ دنازیست آسیا، نکات کلیدی و مهم طراحی پرایمر مطرح شدند. برای طراحی پرایمر استفاده از یک نرم افزار تخصصی بسیار ضروری است. با این حال به منظور طراحی بهینه لازم است تا اطلاعات پایه‌ای مطرح شده در این پست مورد توجه باشند. این اطلاعات برای این که چه مواردی در استفاده از نرم افزار مورد توجه قرار گیرند و بر اساس چه معیارهایی از بین پرایمرهای طراحی شده انتخاب صورت گیرد لازم می‌باشند.

نظر شما راجع‌به این راهنما چیست؟ تجربه‌های موفق و ناموفق خود در طراحی پرایمر را با ما و سایر محققین به اشتراک بگذارید.

منابع

• http://www.premierbiosoft.com
• https://www.idtdna.com

گردآوری توسط دپارتمان بیولوژی مولکولی شرکت دنازیست آسیا