راهنمای عملی سنجش (آنالیز) کیفیت RNA استخراج شده

اهمیت کیفیت مطلوب RNA تخلیص شده

استخراج RNA با کمیت و کیفیت بالا یکی از نیازهای اساسی مطالعات زیست شناسی مولکولی و اولین گام در بسیاری از تست‌های معمول آزمایشگاهی است. تخلیص RNA با کیفیت مطلوب برای بسیاری از کاربردهای پایین دست مانند کلونینگ، رونویسی معکوس برای سنتز cDNA، RT-PCR، RT-qPCR، Northern blotting، cDNA microarray و RNA-seq بسیار مهم می‌باشد. تخلیص RNAی کل از سلول‌ها، خون، بافت‌ها و نمونه‌های دیگر می‌تواند با استفاده از روش‌های مختلفی از جمله استفاده از معرف‌های گوانیدیم و فنل (Phenole) و به دنبال آن ته‌نشینی با کلرید لیتیم و اتانول و دانه‌های مغناطیسی (magnetic beads) انجام شود. از طرف دیگر، کیت‌های تجاری جداسازی RNA، حاوی سیستم‌های بافری بهینه شده و ستون‌های سیلیکا می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند. صرف نظر از روش مورد استفاده، برای جداسازی و استخراج RNA بصورت موفقیت آمیز، محدود کردن فعالیت ریبونوکلئاز (RNase) با حفظ شرایط دمایی مناسب (۴ درجه سانتیگراد) حیاتی است. همچنین پس از استخراج و تخلیص RNA، کمیت و کیفیت RNA استخراج شده باید مورد بررسی دقیق قرار بگیرد. کیفیت مطلوب RNAی استخراج شده در مقادیر مناسب، تضمین کنندهٔ صحت و دقت کاربردهای آزمایشگاهی پایین دست بعدی است.

۴ پارامتر (معیار) کلیدی که باید بعد از استخراج RNA بررسی شوند.

بطور معمول، چهار پارامتر برای تعیین کمیت و کیفیت RNA استخراج شده مورد مطالعه قرار می‌گیرد.

۱- غلظت RNAی استخراج شده (نانوگرم در مایکرولیتر)

یکی از روش‌های ساده، سریع و مناسب برای اندازه گیری معمولی غلظت RNA، آنالیز اسپکتروفوتومتری (طیف سنجی) نمونه‌های RNA با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر مایکرو حجم (micro-volume spectrophotometer یا نانودراپ) است.
البته این دستگاه برای نمونه‌های رقیق (کمتر از ۲۰ نانوگرم در میکرولیتر) عملکرد خوبی ندارد. همچنین برای اندازه‌گیری غلظت‌های «مطلق» مناسب نیست، زیرا ماکرومولکول‌هایی نیز ممکن است همراه با RNA استخراج شوند که طیف‌های جذبی مشابهی داشته باشند. به عنوان مثال اگر نمونهٔ RNA با DNase تیمار نشده باشد، غلظت خوانش شده می‌تواند توسط آلودگی DNA متاثر شود. تنها راه برای خوانش دقیق در این موارد، استفاده از روش‌های فلوریمتری (Fluorimetric) مانند Qubit است. در یادداشت‌های بعدی، این روش مورد بحث قرار خواهد گرفت.
روش اسپکتروفتومتری بر اساس میزان عبور یا جذب نور ماوراء بنفش توسط ماده است. در مورد DNA و RNA، نمونه‌ها در طول موج ۲۶۰ نانومتر (A۲۶۰) در معرض نور ماوراء بنفش قرار می‌گیرند و نوری که از داخل نمونه عبور می‌کند توسط یک دستگاه گیرنده (ردیاب) اندازه‌گیری می‌شود. مقداری از نور ماوراء بنفش، عبور کرده و مقداری توسط DNA / RNA جذب می‌شود. هر چه جذب نوری توسط نمونه بیشتر باشد، یعنی غلظت اسید نوکلئیک در نمونه بیشتر است. بنابراین نورِ کمتر ثبت شده توسط دستگاه ردیاب، چگالی نوری (Optical Density; OD) بالاتری را تولید می‌کند.

۲- خلوص RNA یا RNA purity

اسپکتروفتومتر قادر است علاوه بر تعیین میانگین غلظت اسیدهای نوکلئیک DNA یا RNA موجود در مخلوط، خلوص آنها را نیز تعیین کند. خلوص نمونه های RNA استخراج شده، با بررسی نسبت‌های OD بدست آمده در طیف سنجی معمولی به سرعت قابل ارزیابی است.
در RNA خالص، نسبت جذب نوری ۲۶۰ نانومتر به ۲۸۰ نانومتر (260/280 ratio) حدود ۱.۹ – ۲.۰ است.

• مقدار پایین تر نشان دهنده آلاینده‌های پروتئینی است. آلودگی پروتئین می‌تواند بسیاری از فرایندهای پایین دست بعدی، مانند reverse transcription و qPCR را متاثر کند.
• برای بهبود نسبت‌های ۲۶۰ به ۲۸۰، بهترین راه حذف آلودگی پروتئینی است. برای این منظور استفاده بیشتر از آنزیم پروتئیناز K (یا proteinase K) و انکوباسیون در طول شب می‌تواند موثر باشد.

در RNA خالص، نسبت جذب ۲۶۰ نانومتر به ۲۳۰ نانومتر (260/230 ratio)، حدود ۲.۰ -۲.۲ است.

• مقدار پایین‌تر نشان دهنده وجود نمک و سایر آلاینده‌ها مانند فنول، EDTA، گوانیدین هیدروکلراید (guanidine hydrochloride) در RNA استخراج شده است. فنولی که در اغلب بافرهای استخراج وجود دارد، دارای اثر مهاری روی اکثر پلی‌مرازها است. بنابراین آلودگی فنلی (و سایر ترکیبات فنولیک) می‌تواند روی روی کاربردهای پایین دست بعدی اثر منفی داشته باشد.
• برای بهبود نسبت های ۲۶۰ به ۲۸۰، می‌توان با استفاده از ستون (spin-column) نمونه‌ها را مجددا تمیز کرد و یا دوباره آن‌ها را رسوب داد. افزودن مراحل شستشوی بیشتر در طی این فرایندها می‌تواند به از بین بردن آلودگی‌ها کمک کند. اگرچه انجام این کار همچنین می‌تواند منجر به از دست دادن مقداری اسید نوکلئیک نیز شود. اما از دست دادن مقدار کمی از نمونه برای رسیدن به نمونه‌های خالص ارزش دارد.

۳- باندهای RNA ریبوزومی

از آن جایی‌که RNAهای ریبوزومی (rRNAs)، ۷۰ درصد RNAی کل سلول را تشکیل می‌دهند، بنابراین مشاهده‌ی باندهای RNAهای ربیوزومی، بصورت شارپ و واضح روی ژل آگارز، می‌تواند نشان‌گر یک استخراج با کیفیت مطلوب باشد. در حالی‌که وجود باندهای تخریب شده برای RNAهای ریبوزومی، حاکی از تخریب احتمالی سایر RNAهای سلول و کیفیت پایین تخلیص است.
RNAهای ریبوزومی به دست آمده از سلول‌های مختلف، دارای اندازه‌های متفاوتی هستند که در جدول ذیل مشخص شده است.

در RNA خوب به دست آمده از نمونه های یوکاریوتی، بایستی شدت باند 28S به باند 18S، به نسبت ۲ به ۱ باشد. در RNA خوب به دست آمده از نمونه های پروکاریوتی، بایستی شدت باند 23S به باند 16S، به نسبت ۲ به ۱ باشد.

۴- یکپارچگی RNA یا RNA integrity

به دلیل حضورِ فراگیر RNaseها در محیط، RNA بسیار مستعد تخریب‌شدن است. بنابراین بررسی یکپارچگی RNA یکی دیگر از معیارهای مهمِ آنالیز RNAی استخراج شده است که با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز (۱٪) قابل ارزیابی است. با مقایسه‌ی ضخامت و شدت (شارپی) باندهای بدست آمده روی ژل، می توان به کیفیت RNAی استخراج شده پی برد. شکستگی قطعه‌های RNA در طی استخراج که به صورت اسمیر روی ژل دیده می‌شود، به عنوان معیاری برای کیفیت پایین‌تر نمونه‌های استخراج شده است. همچنین آلودگی RNAی استخراج شده به DNAی ژنومیک، بصورت یک باند مجزا در نزدیکی چاهک روی ژل قابل رویت است. برای حفظ یکپارچگی RNA تخلیص شده، از فریز کردن و ذوب کردن متناوب آن پرهیز کنید. بمنظور جلوگیری از فریز و ذوب شدن مکرر نمونه‌ی RNAی تخلیص شده، بهتر است پس از استخراج، نمونه‌ی RNA به دست آمده در حجم‌های کمتری تقسیم یا الیکوات (Aliquot)، و در فریزر ۸۰- نگهداری شود بطوری‌که برای هر بار استفاده فقط یکی از حجم‌های تقسیم شده استفاده گردد. روش های دیگری نیز برای بررسی یکپارچگی RNA وجود دارند که در یادداشت‌های بعدی به آن‌ها می‌پردازیم.

بررسی کیفیت RNA توسط الکتروفورز ژل آگارز.
باندهای 28S و 18S در نمونه ی RNAی یوکاریوتی مشخص شده است.
چاهک‌های ۱ و ۲: نمونه هایی از RNA ی سالم با نسبت شدت باند 28S به 18S، تقریباً ۲ به ۱ هستند.
چاهک ۳: نمونه‌ای از RNA تخریب شده با اسمیری از RNA در زیر باندهای 28S و 18S می‌باشد.
چاهک ۴: نمونه‌ای از تخریب RNA و در نتیجه از بین رفتن باند 28S و تجمع RNA تخریب شده در نزدیکی پایین ژل است.
چاهک ۵: نمونه‌ای از RNA، با آلودگی قابل ملاحظه به DNA ژنومی (gDNA) است.

نتیجه‌گیری

در این پست از بلاگ دنازیست، در رابطه با اهمیت و روش‌های اندازه‌گیریِ کمی و بررسیِ کیفی RNA استخراج شده از نمونه‌های مختلف صحبت کردیم. با توجه به اهمیت کمیت و کیفیت مطلوب RNAی تخلیص شده و تاثیر آن بر روی کاربردهای پایین دست بعدی، انتخاب روش و کیت استخراج RNA مناسب بسیار مهم و حیاتی است. روش‌های دستی قدیمی و کیت‌های تجاری مختلفی برای این منظور مورد استفاده قرار می‌گیرند.

تجربه شما در رابطه با استخراج RNA چیست؟ لطفا تجارب ارزشمند خود را در قسمت «دیدگاه‌ها» با ما و سایرین به اشتراک بگذارید.

اگر در رابطه با فرایند استخراج و جداسازی RNA سوال یا ابهامی دارید؛ در قسمت «دیدگاه‌ها» بنویسید، محققین بخش «تحقیق و توسعه» دنازیست در کنار شما هستند.

منابع

Guidelines for RNA Quantitation | NEB
RNA quantification and analysis | QIAGEN
Assessment of Nucleic Acid Purity | Thermo Fisher Scientific
Image Sources: Main Pic | Nanodrop Result | Gel Result

تهیه شده توسط دپارتمان بیولوژی مولکولی شرکت دنازیست آسیا