کشت سلول: چالش pH، دما و CO2

انکوباتور کشت سلول

انکوباتور با توانایی تامین دمای مناسب و تنظیم میزان pH محیط کشت سلول از طریق کنترل میزان CO₂ ورودی، بخش مهم و جدائی ناپذیری از آزمایشگاه‌های کشت سلول می‌باشد. انکوباتور توانایی حمایت از انواع کشت‌ها شامل بر کشت‌های بسیار ساده سلولی نظیر CHO تا کشت‌های مورد استفاده در ویرایش ژنوم با کمک سیستم CRISPR/Cas را دارد. یک انکوباتور علاوه بر تامین دما، رطوبت و سطوح O₂/CO₂، محیط نسبتا عاری از آلودگی را برای سلول ها فراهم می‌سازد. یکی از دلایل شایع ایجاد نوسان در محیط سلول‌های کشت یافته، باز شدن درب انکوباتور حتی به مدت کوتاه است طوریکه منجر به ورود هوای محیط به داخل انکوباتور شده و سطوح O₂/CO₂ و دما را تغییر داده و همچنین منجر به ایجاد آلودگی‌های بالقوه خواهد شد. هر یک از فرآیندهای سلولی نیازمند pH بهینه می‌باشند تا در آن بهترین فعالیت را داشته باشند. اگر فرآیند سلولی از pH مناسب برخوردار نباشد، تغییرات آنزیمی منجر به اختلال در عملکرد شده و در نتیجه تاثیرات مشابه با تغییرات دمایی شدید بر روی سلول ایجاد خواهد شد. همچنین تغییر در pH منجر به آسیب به ساختار ثانویه پروتئین‌ها یعنی مارپیچ آلفا و صفحات بتا خواهد شد طوریکه دناتوراسیون غیر قابل بازگشت در سطح پروتئین رخ خواهد داد.

pH and CO₂

سلول‌ها میزان کمی دی اکسید کربن (CO₂) برای رشد و بقا نیاز دارند. در محیط‌های کشت، CO₂ محلول در تعادل با یون‌های بیکربنات است و اغلب محیط‌های کشت از این واکنش جهت تنظیم pH محیط بهره می‌برند. CO₂ آزادانه در محیط حل شده و با آب واکنش می‌دهد تا اسید کربنیک تشکیل شود. زمانیکه سلول‌ها CO₂ بیشتری را متابولیزه و تولید کنند، pH محیط طبق واکنش شیمیایی زیر کاهش خواهد یافت:

H₂O + CO₂ ⟺ H₂CO₃ ⟺ H⁺ + HCO₃^–

طیف بهینه‌ی pH (یعنی ۷.۲ تا ۷.۴) می‌تواند توسط بیکربنات سدیم اضافه شده به محیط حفظ شده و سطح CO₂ را در محیط کشت طبق واکنش زیر تنظیم کند:

H₂O + CO₂+ NaHCO₃ ⟺ H⁺ + Na⁺ + 2HCO₃^–

سیستم بافری بیکربنات

سیستم بافری بیکربنات بر مبنای اصل لوشاتلیه (Le Chatelier’s principle) کار می کند. افزایش اسیدیته‌ی محیط در پی افزایش یون‌های ⁺H باعث می‌شود تا یون‌های بیکربنات آزاد با یون های ⁺H مازاد واکنش نشان داده و با تشکیل اسید کربنیک واکنش به سمت چپ یعنی تثبیت pH پیش می‌رود (پیکان قرمز). همچنین، با کاهش یون‌های ⁺H واکنش به سمت راست تغییر جهت خواهد داد (پیکان سبز) تا اسید کربنیک بیشتری تجزیه شود.

نقش و تاثیر فنول رد در محیط کشت سلول

در فرمولاسیون محیط‌های کشت سلول فنل‌رد (phenol red) وجود دارد که به ارزیابی pH محیط کمک می‌کند. تغییر رنگ محیط به دلیل تغییر pH متعاقب آزادسازی متابولیت‌ها توسط سلول است. در سطوح پائین pH، فنول رد رنگ محیط را به زرد و در سطوح بالای pH به رنگ ارغوانی تغییر می‌دهد. محیط استاندارد خریداری شده می‌بایست رنگ قرمز درخشان با pH 7.4 داشته باشد.

توجه داشته باشید که فنول رد می‌تواند عملکرد برخی از هورمون‌های استروئیدی به ویژه استروژن را تقلید کند. در کارهای تحقیقاتی که نیازمند سلول‌های حساس به استروژن (نظیر بافت‌ها و سلول‌های پستانی) می‌باشد، استفاده از محیط بدون فنول رد توصیه می‌شود. همچنین، وجود فنول رد در ترکیبات برخی از محیط‌های عاری از سرم، هومئوستاز یون سدیم-پتاسیم را دگرگون می‌سازد. این تاثیر با اضافه کردن سرم به محیط مرتفع خواهد شد. در مطالعاتی که نیاز به بررسی توسط فلوسایتومتری است، رنگ فنول رد ممکن است با نتایج آزمایش تداخل ایجاد کند. بدین منظور نیاز است تا از محیط های عاری از فنول رد بهره برد.

درصد CO₂ و رطوبت انکوباتور کشت سلول چقدر باید باشد؟

اکثر آزمایشگاه‌های کشت سلول مجهز به انکوباتور با توانایی ایجاد رطوبت و تامین دی‌اکسیدکربن (CO₂) می‌باشند و به طور روتین CO₂ را در عدد ۵٪ تنظیم می کنند بدون آنکه این سوال را از خود بپرسند که چرا CO₂ می‌بایست بدین گونه تنظیم شود؟! این نوع عدم آگاهی به ۲ دلیل می‌باشد: ۱- عدم مطالعه دقیق در مورد محیط کشت خریداری شده، ۲- عدم ارائه اطلاعات فنی دقیق توسط شرکت سازنده محیط کشت.

CO₂ یک نیاز متابولیکی برای کشت‌های سلول نیست و هدف آن حلالیت در محیط کشت و واکنش با آب بمنظور تشکیل اسید کربنیک است تا در ادامه بتواند با باز کونژوگه نظیر یون‌های بیکربنات محلول در محیط واکنش داده و pH فیزیولوژیک محیط را از طریق سیستم بافری بیکربنات کنترل کند.

غلظت CO₂ اتمسفر زمین تنها ۰.۰۴٪ است. در مقابل، انکوباتورهای CO₂ دار بسته به سیستم بافری استفاده شده در فورمولاسیون محیط‌های کشت، بین ۵ تا ۱۰٪ تنظیم می‌شوند. میانگین رطوبت بر روی زمین بسیار پائین است، در حالیکه رطوبت داخل انکوباتور می‌بایست همیشه حالت اشباع ۱۰۰ درصدی داشته باشد. باز کردن متناوب درب انکوباتور، منجر به فرار رطوبت شده و در نتیجه منجر به تبخیر تدریجی محیط کشت خواهد شد. و با گذشت زمان غلظت نمک‌های محیط کشت افزایش یافته و می‌تواند منجر به آسیب یا حتی مرگ سلولی شود. حتی باز گذاشتن درب خارجی انکوباتور به مدت طولانی به درب داخلی شیشه ای این امکان را می دهد تا به عنوان کندانسور عمل کرده و حتی با ثابت نگه داشتن دما رطوبت فضای داخلی را کاهش دهد. در این شرایط، به دلیل وجود غلظت بالای CO₂ در داخل انکوباتور، این رطوبت بسیار شبیه باران اسیدی (اسید کربنیک) خواهد بود.

کربن‌دی‌اکسید (CO₂) در آب سرد حلالیت بالایی دارد و اینکه نوشیدنی های کربناته زمانیکه گرم می‌شوند یا درب شان باز می شود گاز محلول در خود را از دست می‌دهند به همین دلیل است. CO₂ در آب حل می‌شود تا اسید کربنیک تولید کند و تعادل بیکربنات/کربنات را تنظیم کرده و غلظت CO₂ حل شده در دمای مشخص را تعیین می‌کند. دمای سرد واکنش را به سمت راست و دمای گرم آن را به سمت چپ سوق می‌دهد:

H₂O + CO₂ ⟺ H₂CO₃ ⟺ H⁺ + HCO₃^– ⟺ 2H⁺ + CO₃^-2

اسید کربنیک یک اسید ضعیف است و پروتون‌های خود را به راحتی از دست نمی‌دهد. اغلب CO₂ حل شده به صورت اسید کربنیک تجزیه نشده باقی می‌ماند یا با CO₂ اتمسفری تبادل می‌شود. با وجود گرما، غلظت CO₂ انکوباتور واکنش را به سمت راست سوق می‌دهد. فورمولاسیون محیط‌های کشت معمولا برای ۵٪ گاز CO₂ و دمای ۳۷ درجه تنظیم شده‌اند. با این وجود، رطوبت باید همیشه ۱۰۰٪ باشد چراکه آب بخش مهمی از واکنش بالا است.

pH مورد نیاز سلول چقدر است؟

pH فیزیولوژیک در بازه ۷.۲ تا ۷.۴ برای رده‌های سلولی نرمال و برخی از رده‌های سلولی ترانسفورم شده پیشنهاد می‌گردد و برخی از رده‌های سلولی سرطانی نیازمند کشت در pH پائین‌تر از حالت فیزیولوژیک هستند. اغلب رده‌های سلولی پستانداری نرمال به خوبی در pH: 7.4 رشد می‌کنند و اختلاف‌های بسیار جزئی بین سویه‌های سلولی مختلف در این خصوص وجود دارد. با این وجود، برخی رده‌های سلولی ترانسفورم‌شده در محیط‌های نسبتا اسیدی رشد می‌کنند (pH:7.0 – 7.4) و برخی از رده‌های سلولی فیبروبلاستی نرمال محیط‌های نسبتا بازی را ترجیح می ‌هند (pH: 7.4 – 7.7). رده‌های سلولی حشرات نیز pH: 6.2 را ترجیح می‌دهند.

نقش بافری بیکربنات سدیم در محیط کشت

میزان سدیم بیکربنات در محیط کشت، میزان CO₂ ای که بمنظور حفظ pH استفاده می‌شود را تعیین خواهد کرد. به طور کلی، اگر محیط کشت حاوی ۱.۲ تا ۲.۲ گرم در لیتر بیکربنات سدیم باشد میزان CO₂ مورد نیاز ۵٪ خواهد بود در حالیکه اگر محیط کشت حاوی ۳.۷ گرم در لیتر بیکربنات سدیم باشد میزان CO₂ بهتر است ۱۰٪ در نظر گرفته شود. در برخی موارد، ظرف کشت با جریان استریل دی‌اکسید‌کربن (۵٪) و هوا (۹۵٪) گازدهی‌شده و درب ظرف کشت محکم بسته می‌شود تا بتوان انکوباسیون آنها ار در انکوباتورهای بدون رطوبت و CO₂ انجام داد.

سایر بافرهای محیط کشت سلول

در فورمولاسیون برخی از محیط‌های کشت، سیستم‌های بافری متفاوتی نظیر فسفات یا HEPES به همراه سدیم بیکربنات وجود دارد که کاربرد اصلی آن حفظ بهینه pH در سیستم‌های باز، زمانی که ظرف کشت از اتمسفر غنی از CO₂ خارج می‌شود، می‌باشد. HEPES و سایر بافرهای آلی می‌توانند با رده‌های سلولی زیادی استفاده شده و بطرز کارآمدی pH محیط را تنظیم کنند. در واقع، برخی از فرمولاسیون‌های استاندارد محیط حاوی HEPES است. با این وجود، این ترکیب می‌تواند خاصیت توکسیک به ویژه برای برخی از رده‌های سلولی تمایز یافته داشته باشد، لذا بررسی اثرات سوء آن قبل از استفاده لازم است. نشان داده شده است که HEPES شدیدا حساسیت محیط به تاثیرات فتوتوکسیک القا شده توسط تابش نور فلورسنت را افزایش می‌دهد.

درصد بهینه CO₂ برای محیط کشت‌های مختلف

بازه‌های تئوریک pH برای محیط‌های مختلف کشت در نمودار زیر نشان داده شده است. در این نمودار، پائین‌ترین و بالاترین بازه فیزلوژیک pH برای کشت سلول به ترتیب با خط افقی قرمز (pH: 7.2) و خط افقی سبز (pH: 7.4) نشان داده شده است. محیط DMEM با 44mM NaHCO₃ (خط نارنجی) توسط غلظت‌های ۷.۵٪ تا ۱۱٪ از CO₂، در pH فیزیولوژیک قرار می‌گیرد. استفاده از DMEM در محیط با CO₂ به میزان ۵٪، منجر می‌شود تا pH به ۷.۵ تغییر یابد. اگرچه این pH برای اکثر کشت‌های سلول قابل قبول است ولی خارج از محدوده فیزیولوژیکی می‌باشد. EMEM حاوی BSS با 26mM NaHCO₃ (خط سبز پررنگ) توسط غلظت‌های ۴.۵٪ تا ۷.۵٪، در pH فیزیولوژیک قرار می‌گیرد در حالیکه درصد پائین CO₂ (نزدیک به سطوح اتمسفری) برای EMEM حاوی Hank’s BSS با 4mM NaHCO₃ (خط آبی) لازم است.

این اطلاعات تئوریک نشان می‌دهد که اکثر محیط‌های کشت سلول با 26mM NaHCO3 در دمای ۳۷ درجه می‌بایست در مجاورت ۵٪ گاز CO₂ قرار بگیرند. توجه داشته باشید که DMEM با 44mM NaHCO3 نیازمند میزان بالاتری از CO₂ خواهد بود (یعنی ۷.۵٪ تا ۱۱.۵٪). محققان باید توجه داشته باشند که بهره گیری از ۵٪ گاز CO₂ با DMEM منجر به ایجاد pH ای بالاتر از میزان فیزیولوژیک خواهد شد. با این وجود، در اکثر موارد اسید لاکتیک و CO₂ ایجاد شده توسط کشت‌های در حال رشد سالم این pH بالا را تصحیح خواهند کرد. در کشت‌هایی با دانسیته‌ی بسیار پائین یا سلول‌هایی با رشد پائین (زمان دوبرابر شدن طولانی – doubling time) در محیط DMEM، افزایش CO₂ در انکوباتور ممکن است منجر به رشد مناسب سلول‌ها شود. به خاطر داشته باشید که درصدهای بالاتر CO₂ با جانشین شدن به جای اکسیژن در انکوباتور، منجر به کاهش اکسیژن در دسترس برای سلول‌ها خواهد شد. بنابراین درصدهای بالاتر از ۱۰٪ پیشنهاد نمی‌شود.

جهت اطمینان از کارکرد صحیح دما و CO₂ بسیار مهم است تا انکوباتورهای CO₂ بطور دقیق و دوره‌ای کالیبره و سرویس شوند. بدین منظور می‌توان از دستگاه های پرتابل نظیر Geotech G100 استفاده کرد.

دمای بهینه برای کشت انواع سلول‌های جانوری

دمای اپتیمم (Optimum Temperature) برای کشت سلول بطور عمده وابسته به دمای بدن میزبانی است که سلول‌ها از آن جدا شده‌اند و تا حدودی وابسته به جایگاه آناتومیکی سلول‌ها می‌باشد؛ بطور مثال دمای پوست ممکن است پائین‌تر از دمای عضله اسکلتی باشد. تاثیرات افزایش دما بر روی سلول‌های کشت‌یافته منجر به ایجاد مشکلات جدی‌تری نسبت به کاهش دما خواهد شد. بنابراین، بهتر است دما در انکوباتور بطور جزئی کمتر از دمای بهینه تنظیم شود.

• اغلب رده‌های سلولی انسانی و پستانداری در دمای ۳۶ تا ۳۷ درجه نگهداری می‌شوند؛
• سلول‌های حشره برای رشد بهینه در دمای ۲۷ درجه کشت می‌یابند. در دمای بالای ۳۰ درجه، مانایی سلول‌های حشرات کاهش می‌یابد و معمولا حتی بعد از اینکه دمای ۲۷ درجه تامین شود سلول‌ها ریکاور نخواهند شد؛
• رده‌های سلولی پرندگان برای رشد بهینه به دمای ۳۸.۵ درجه نیاز دارند. اگرچه این سلول‌ها می‌توانند در ۳۷ درجه نیز رشد کنند ولی سرعت رشد آنها کاهش خواهد یافت؛
• رده‌های سلولی مشتق از حیوانات خون سرد دمای بین ۱۵ تا ۲۶ درجه را تحمل خواهند کرد.

منابع

• Thermofischer’s cell culture basics handbook
• ATCC® animal cell culture guide
• Freshney, R. I. (2010) Culture of Animal Cells John Wiley & Sons, Inc.

گردآوری توسط دپارتمان بیولوژی سلولی شرکت دنازیست آسیا

محیط‌های کشت سلول و مواد افزودنی دنازیست